Csbf / c10orf99, новий потенційний цитокін, пригнічує ріст клітин ракової кишки через індукцію арешту g1 | наукові доповіді

Csbf / c10orf99, новий потенційний цитокін, пригнічує ріст клітин ракової кишки через індукцію арешту g1 | наукові доповіді

Anonim

Предмети

  • Цитокіни
  • Онкогени

Анотація

Цитокіни - це розчинні білки, які здійснюють свої функції, зв'язуючи специфічні рецептори. Багато цитокінів відіграють важливу роль у канцерогенезі та були розроблені для лікування раку. У цьому дослідженні ми ідентифікували новий потенційний цитокін за допомогою імуногеноміки, позначеного пов'язуючим фактором SUSD2 товстої кишки (CSBF), також відомим як хромосома 10 відкритої рамки читання 99 (C10orf99). CSBF / C10orf99 - класичний секретується білок з прогнозованою молекулярною масою 6, 5 кДа і функціональним лігандом домену суші, що містить 2 (SUSD2). CSBF / C10orf99 має найвищий рівень експресії в тканинах товстої кишки. І CSBF / C10orf99, і SUSD2 регулюються вниз в тканинах раку товстої кишки та клітинних лініях з різними механізмами регуляції. CSBF / C10orf99 взаємодіє з SUSD2 для інгібування росту клітин раку товстої кишки та індукування зупинки клітинного циклу G1 шляхом регуляції цикліну D та циклінозалежної кінази 6 (CDK6). CSBF / C10orf99 відображає дзвіноподібну криву активності з оптимальним ефектом при ~ 10 нг / мл Його інгібіторний вплив на зростання може бути блокований розчинним білком sSUSD2-Fc. Наші результати свідчать про те, що CSBF / C10orf99 є новим потенційним цитокіном із супресорними функціями пухлини.

Вступ

Цитокіни - це невеликі білки, що секретуються (~ 5–20 кДа), які зв’язують специфічні рецептори для здійснення їх дії паракриновим або аутокринним способом 1, 2 . Вони продукуються імунними клітинами, такими як дендритні клітини 3, NK-клітини 4 та Т-лімфоцити 5, 6 та неімунні клітини 7, включаючи ендотеліальні клітини 8, фібробласти 9, 10, стромальні клітини 11, 12 та ін. Цитокіни відіграють важливу роль у імунній відповіді, запаленні та канцерогенезі 13, 14, 15, 16 . EGF (епідермальний фактор росту) 17, VEGF (фактор росту ендотелію судин) 18 та HGF (фактор росту гепатоцитів) 19 мають значний вплив на онкогенез, і вони розроблені як мішені для терапії пухлин. З іншого боку, деякі цитокіни функціонують як супресори пухлин, запобігаючи та пригнічуючи розвиток раку 20, такі як онкостатин М (OSM) 21 та інтерлейкін-24 (IL-24) 22 . OSM - це багатофункціональний цитокін, пов'язаний з інтерлейкіном 6, який пригнічує проліферацію різних твердих клітинних ліній пухлини. IL-24 - супресор пухлини цитокінів, який ідентифікували спочатку як молекулу, пов'язану з диференціацією меланоми. IL-24 є одним з цитокінів сімейства IL-10 і інгібує ріст, інвазію та міграцію пухлинних клітин, індукуючи апоптоз пухлинних клітин та зупинку клітинного циклу G1 із зниженою регуляцією Циклін D. IL-24 значно знижується в колоректальній формі ракові (CRC) тканини порівняно з тканинами сусідньої нормальної слизової з посттранскрипційними модифікаціями 23 .

CRC є третім найпоширенішим раком у світі 24 . Його розвиток - це багатоетапний процес, який характеризується складною взаємодією між генетичними змінами та імунною системою господаря 25, 26 . Прото-онкогени, включаючи K-ras і c-myc 27, відіграють важливу роль у колоректальному канцерогенезі. З іншого боку, великі значення для цього процесу мають також гени супресорних пухлин (ТГГ) 28, 29, такі як p16, p21, p27, p53, APC, DCC та MMR. ТГГ пригнічують нестримне ділення клітин у нормальних клітинах і обмежують ріст пухлинних клітин, уповільнюючи поділ клітин, виправляючи помилки ДНК та індукуючи запрограмовану загибель клітин. Однак втрата функції або зниження експресії ТТГ, що викликається генетичною мутацією, делецією алелів, метилюванням промотору або іншими механізмами, можуть сприяти розвитку неконтрольованого росту клітин раку. ЦРЛ можна лікувати хірургічним шляхом на ранніх стадіях 30, але зазвичай метастазує в момент встановлення діагнозу, що вимагає хіміотерапії. Однак хіміотерапія не дуже ефективна при наявності метастазів, при цьому рівень виживаності нижчий за 10%. В сукупності невдача ранньої діагностики та резистентність до терапії є головними причинами смерті від CRC 31, 32, 33 .

Наразі багато цитокінів та пов'язаних з ними білків розроблено для лікування онкологічних захворювань 34 . Наприклад, пухлинно-специфічні терапії щодо СРС зазвичай використовують Авастин (бевацизумаб) 35 або Ербітукс (цетуксимаб) 36, поєднаний із традиційною хіміотерапією. Авастин пригнічує ріст судин, блокуючи VEGF, а Ербітукс зменшує ріст раку, зв'язуючи EGFR. Клінічне випробування I фази з використанням рекомбінантного вектора аденовірусу, що експресує IL-24 (Ad-IL24 / INGN241), повідомляло, що лікування Ad-IL24 має вимірний ефект знищення пухлини у понад 40% пацієнтів 37 . Отже, буде важливо визначити та охарактеризувати нові цитокіни як для базових досліджень, так і для клінічного застосування.

Для виділення нових потенційних цитокінів ми створили платформу, використовуючи імуногеноміку, як повідомлялося раніше 38, і знайшли кілька секретованих білків з важливими функціями. CSBF / C10orf99 є одним з них. Тут ми показуємо, що CSBF / C10orf99 - це класичний секретується білок з невеликими молекулярними розмірами. Він має найвищий рівень експресії в нормальній тканині товстої кишки і зменшується в тканинах раку товстої кишки та клітинних лініях. CSBF / C10orf99 взаємодіє з SUSD2 для інгібування росту клітин раку товстої кишки та індукування зупинки клітинного циклу G1 шляхом регуляції цикліну D та циклінозалежної кінази 6 (CDK6). Він показує дзвіноподібну криву активності з максимальним ефектом при ~ 10 нг / мл, і розчинний білок sSUSD2-Fc може блокувати його функції. Наші результати демонструють, що CSBF / C10orf99 є новим потенційним цитокіном із супресорною активністю.

Результати

CSBF / C10orf99 - класичний секретний білок

Повна кДНК та виведені амінокислотні послідовності CSBF / C10orf99 показані на Фіг.1а. КДНК CSBF / C10orf99 містить типовий сигнал для поліаденіляції (AATAAA) в межах 3 'UTR і Kozak послідовності (CACCATG) 39 в межах 5' UTR. CSBF / C10orf99 складається з 81 амінокислоти, що містить сигнальний пептид, передбачений сигналом сервера SignalP 4.0 (//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) і домен трансмембранного спіралі в N-терміналі, передбачений TMHMM Server v . 2.0 (//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/). Домен трансмембранного спіралі знаходиться в сигнальному пептиді.

Image

(a) Показані кДНК та виведені амінокислотні послідовності CSBF / C10orf99. Прогнозований сигнальний пептид на 5 'кінці вводиться курсивом. Домен трансмембранних спіралей позначений червоним кольором. Сигнал зупинки замінюється зірочкою. Підсумковий сигнал для поліаденілювання на 3 'кінці підкреслено. (b) Підклітинну локалізацію CSBF / C10orf99 визначали за допомогою мікроскопії. Вгору трансфіковані клітини HEK 293T фіксували та фарбували анти-myc та Hoechst 33258. EGFP показано зеленим кольором, тоді як фарбування анти-myc показано червоним кольором. Локалізацію CSBF-myc-His та зазначеного GFP-злитого білка спостерігали за допомогою конфокальної лазерної скануючої мікроскопії (LSM). Показані дані є репрезентативними для щонайменше трьох незалежних експериментів. Шкала бар = 25 мкм. Внизу клітини, що експресують DsRed-ER, DsRed-Golgi та CSBF-myc-His, фіксували, фарбували та спостерігали за LSM. (c) Вестерн-блот-аналіз CSBF / C10orf99 використовував мишаче анти-людське IgG (Fc-специфічне) антитіло. Клітини HEK 293T, трансфіковані pwYD11-CSBF-Fc (pwYD11, модифікований вектор, отриманий Національним науково-дослідним науково-дослідним інститутом біотехнології, Канада) або контрольним вектором, культивували за відсутності або наявності 10 мкг / мл BFA. Супернатанти та лізати клітин готували через 48 годин після трансфекції. GAPDH було виявлено як контроль завантаження. Показані дані є репрезентативними для щонайменше трьох незалежних експериментів.

Повнорозмірне зображення

Після молекулярного клонування CSBF / C10orf99 ми провели імунофлуоресцентну мікроскопію для визначення субклітинної локалізації CSBF / C10orf99 у pcDNA3.1-CSBF-myc-His трансфікованих HEK 293T клітин. Як показано на малюнку 1b вгору, червона флуоресценція, представлена ​​CSBF-myc-His, була розташована в цитозолі. Це було підтверджено трансфекцією іншої плазміди CSBF / C10orf99 з міткою GFP. Зелені сигнали флуоресценції показали, що CSBF-EGFP також мав цитоплазматичну локалізацію. На клітинній мембрані або в ядрі не було подано жодного сигналу. Маркери DsRed-органели (DsRed-ER та DsRed-Golgi) були використані для точного визначення локалізації CSBF-myc-His. Результати показали, що CSBF-myc-His знаходився в просвіті внутрішньоклітинного відділення по класичному шляху секреції (мал. 1б, вниз).

Розчинні білки, що містять N-кінцеві сигнальні пептиди, зазвичай секретуються класичним шляхом, залежним від ER / Golgi, який може бути заблокований брефеліном A (BFA) 40 . Для підтвердження того, що CSBF / C10orf99 секретується класичним шляхом, ми виявили білок CSBF-Fc у супернатанті клітинної культури, трансфікований плазмідою pwYD11-CSBF-Fc, а потім провели аналіз інгібування BFA. Як показано на Фіг. 1в, лікування БФА знижувало секрецію CSBF-Fc, підтверджуючи, що CSBF / C10orf99 є класичним секреторним білком. Очищений білок CSBF-Fc додатково секвенсували реакцією деградації Едмана 41, 42 . Як показано на додатковій фігурі S1, N-кінцева послідовність KRRPAKAWSG відповідає відповідно до прогнозу SignalP.

CSBF / C10orf99 є лігандом SUSD2

У сукупності вищезазначені результати підтвердили, що CSBF / C10orf99 є білком класичного секрету. Попередні дослідження показали взаємодію з високою довірою між CSBF / C10orf99 та SUSD2, а також Gal1 та SUSD2 43 . SUSD2 кодує мембранний білок 822-амінокислоти I типу, що містить позаклітинні домени SO, AMOP, VWD та CCP (додаткова фігура S2a) 44 . Для того, щоб визначити, чи ці чотири домени незамінні для розташування та функції SUSD2, ми побудували усічені мутанти цих чотирьох позаклітинних доменів і перевірили виразність цих конструкцій (додаткова фігура S2b). Потім ми досліджували субклітинну локалізацію цих мутантів у клітинах LoVo. Додаткова фігура S2c показала різні схеми експресії повної довжини SUSD2 та всі ці мутанти. У порівнянні з диким типом SUSD2, всі ці мутанти рясніють цитоплазмою, що дозволяє припустити, що відсутність будь-якого з цих чотирьох доменів змінить локалізацію цього білка, що може додатково вплинути на його функції. Отже, наступні дослідження включали лише функцію інтактного білка SUSD2.

Щоб перевірити взаємодію між SUSD2 та CSBF / C10orf99, ми побудували вектор експресії дискронічного ссавця 20, pcDNA3-SUSD2-HA :: IRES-CSBF-Flag, який використовував похідний від вірусу елемент IRES для спільної експресії SUSD2 -HA та CSBF-Flag. Потім ми провели ко-імунопреципитацію (ко-IP). Як показано на малюнку 2а, ми виявили, що CSBF / C10orf99 спільно імунопреципіювали з SUSD2 і навпаки, що вказує на те, що два білки були в одному комплексі.

Image

(a) Co-IP комплексу CSBF-SUSD2. Дослідження ко-IP проводили з лізатами, отриманими з клітин HEK 293T. Клітини трансфікували CSBF-Flag, SUSD2-HA або контрольним вектором окремо для контролю. Білки, що містять SUSD2, імунопреципітували моноклональним антитілом до НА та потім блотували за допомогою моноклонального антитіла проти Флагу. Взаємно білки, що містять CSBF, імунопреципітували проти анти-прапорця, а потім блотували за допомогою антитіла проти НА. Показані дані є репрезентативними для щонайменше трьох незалежних експериментів. (b) Вгору, інтерналізація SUSD2 була викликана CSBF / C10orf99. Клітини LoVo, що швидко експресують SUSD2-EGFP, обробляли CSBF / C10orf99 (0, 10, 100 та 500 нг / мл) при 37 ° C протягом 30 хвилин, фіксували та фарбували Hoechst 33258. SUSD2-EGFP, спостережуваний конфокальним LSM, показано на зелений. Показані дані є репрезентативними для щонайменше трьох незалежних експериментів. Шкала бар = 25 мкм. Внизу клітини, що експресують SUSD2-EGFP або / і DsRed-Rab5, обробляли CSBF / C10orf99 (500 нг / мл). (c) FRET був виведений між CSBF-mCherry та SUSD2-EGFP конфокальним LSM. Ефективність FRET E = 1 - F D '/ F D, де F D ' і F D - інтенсивність донорної флуоресценції відповідно і без акцептора. Gal1 - позитивний контроль ліганду. Гістограма представляє середнє значення ± SD. (d, e) Підгонка кривої показала спорідненість зв'язування радіоліганду до sSUSD2-Fc. Аналіз зв'язування радіоліганду був проведений між CSBF та sSUSD2-Fc. Gal-1 є позитивним контролем ліганду.

Повнорозмірне зображення

Оскільки інтерналізація, залежна від ліганду, є характеристикою рецептора 45, нам далі вдалося підтвердити, чи проходить SUSD2 цей процес. По-перше, локалізація SUSD2-EGFP була виявлена ​​на плазматичній мембрані pEGFP-N1-SUSD2, трансфікованих клітинами LoVo (додаткова фігура S2c). Тоді ми з’ясували, що CSBF / C10orf99 викликав інтерналізацію SUSD2-EGFP залежно від дози (рис. 2б). Для точного визначення інтерналізації SUSD2-EGFP був використаний маркер ендосоми (DsRed-Rab5). Як показано на малюнку 2b вниз, інтерналізований SUSD2-EGFP знаходився в ендосомі. Це показало, що CSBF / C10orf99 може зв'язувати SUSD2 та запускати інтерналізацію рецепторів.

Крім того, щоб визначити, чи може CSBF / C10orf99 безпосередньо зв'язувати SUSD2, ми використовували in situ флуоресцентний резонансний перенос енергії (FRET) для підтвердження ко-локалізації між CSBF-mCherry та SUSD2-EGFP. Енергія флуоресценції могла переходити від EGFP до RFP, коли відстань між ними становило менше 10 нм. Людський галектин-1 (Gal1) використовували як позитивний контроль ліганду. На малюнку 2с узагальнений результат аналізу FRET. Ефективність FRET CSBF / SUSD2 становила 15, 2%, трохи вище, ніж у позитивного контролю ліганду Gal1 / SUSD2 (11, 6%), з плавленим EGFP-mCherry 46 як позитивний контроль FRET (25, 9%).

Для подальшого з'ясування біохімічної природи взаємодії CSBF / SUSD2 ми виміряли спорідненість CSBF / C10orf99 до очищеної позаклітинної області SUSD2, яка є розчинною формою SUSD2, що утворюється шляхом злиття позаклітинної частини SUSD2 до області Fc людського IgG1 (sSUSD2 -Fc) (додаткова малюнок S3). Аналіз зв'язування конкуренції проводили для виявлення спорідненості між CSBF / C10orf99 та sSUSD2-Fc після того, як CSBF / C10orf99 мітили 125 I. Значення IC50 визначали нелінійною регресією конкурентного зв'язування. Як показано на малюнку 2e, підгонка кривої показала, що не маркований CSBF / C10orf99 витіснив 125 I-мічений CSBF / C10orf99 з sSUSD2-Fc з IC 50 0, 28 нМ, тоді як Gal1 з IC 50 0, 19 нМ. Ці разом разом підтвердили, що CSBF / C10orf99 є лігандом SUSD2.

CSBF / C10orf99 і SUSD2 знижуються в тканинах раку товстої кишки

Оскільки CSBF / C10orf99 є новим секретним білком, щоб дізнатися більше про його функції, ми спочатку шукали профіль експресії з відомих баз даних. Аналіз GEO профілю (GDS3113) показав, що CSBF / C10orf99 сильно експресується в тканині товстої кишки і помірно експресується в тканині мигдалини серед 96 зразків. База даних SAGE (//cgap.nci.nih.gov/SAGE/AnatomicViewer) та Atlas протеїну людини (www.proteinatlas.org) повідомили, що CSBF / C10orf99 є регульованим в тканинах колоректального раку.

Потім ми дослідили схему експресії CSBF / C10orf99 у нормальних тканинах людини за допомогою RT-PCR та ПЛР у реальному часі, яка була виявлена ​​на трьох панелях кДНК від Clontech, включаючи дві бібліотеки кДНК множинних тканин (16 зразків) та одну кДНК імунної системи бібліотека (7 зразків). Як показано на малюнках 3a та 3b, мРНК CSBF / C10orf99 виявлена ​​в специфічних тканинах: на найвищому рівні в товстій кишці, при помірному рівні в мигдалині і майже не виявляється в інших тканинах.

Image

(a) Експресію CSBF / C10orf99 здійснювали за допомогою RT-PCR. Проаналізовано три панелі кДНК від Clontech, включаючи дві бібліотеки кДНК з декількома тканинами та одну бібліотеку кДНК тканин імунної системи. GAPDH був виявлений як референсний ген. (b, d) Експресію CSBF / C10orf99 та SUSD2 здійснювали за допомогою ПЛР у реальному часі. GAPDH був виявлений як референсний ген. ПЛР у реальному часі проводили у трьох примірниках, середнє значення ± SD показано. (c, e) Низька регуляція CSBF / C10orf99 або SUSD2 була виявлена ​​в первинних колоректальних раках за допомогою ПЛР у реальному часі. N / C, парні сусідні тканини / ракові тканини. GAPDH був виявлений як референсний ген. (f) Представники імуногістохімічного фарбування на CSBF / C10orf99 та SUSD2 в одній парі тканини колоректального раку та сусідньої тканини. Збільшення: 400 разів.

Повнорозмірне зображення

Далі ми виявили експресію CSBF / C10orf99 на кДНК-панелі, отриманій із 42 пар раку товстої кишки та сусідніх тканин. Як показано на малюнку 3c, експресія CSBF / C10orf99 різко знижується в більшості первинних тканин раку порівняно з вираженою в сусідніх тканинах. Щоб визначити, чи був CSBF / C10orf99 зниженим регульованим рівнем білка, ми підняли кроляче поліклональне антитіло проти CSBF / C10orf99 із злитим білком GST-CSBF як імуноген та очистили хроматографією спорідненості CSBF / C10orf99. Ми аналізували CSBF / C10orf99 у репрезентативних зразках за допомогою імуногістохімії. Як показано на малюнку 3f, у більшості тканин раку товстої кишки CSBF / C10orf99 був регульований вниз, що відповідало рівню мРНК.

Оскільки наші результати показали, що SUSD2 є рецептором CSBF / C10orf99, ми перевірили профіль експресії SUSD2 далі. Попереднє дослідження показало, що SUSD2 був сильно виражений у легенях та нирках та помірно виражений у молочній залозі за допомогою RT-PCR 44 . Аналіз GEO профілю (GDS3113) показав, що SUSD2 сильно експресується у спинному мозку, шкірі та легенях та помірно експресується в тканинах товстої кишки та молочної залози. База даних SAGE та Атлас протеїнів людини повідомили, що SUSD2 знижується в тканинах колоректального раку. Ми досліджували схему експресії SUSD2 в нормальних тканинах людини за допомогою ПЛР у реальному часі. SUSD2 був сильно виражений у легенях та нирках та виявлявся у тканинах товстої кишки (мал. 3d). Як показано на Фіг. 3e та 3f, SUSD2 також був регульованим як на мРНК, так і на рівні білка в більшості тканин раку товстої кишки.

CSBF / C10orf99 і SUSD2 знижуються в клітинних лініях раку товстої кишки з різними моделями регуляції генів

Вищевказані результати підтвердили, що CSBF / C10orf99 і SUSD2 були значно знижені в тканинах раку товстої кишки. Потім ми спробували дослідити експресію CSBF / C10orf99 та SUSD2 у клітинних лініях раку товстої кишки. Як показано на малюнках 4a та b, і CSBF / C10orf99, і SUSD2 були регульовані вниз по шести клітинним лініям раку товстої кишки.

Image

(a, b) Експресію CSBF / C10orf99 та SUSD2 в шести клітинних лініях здійснювали за допомогою ПЛР у режимі реального часу. в якості позитивного контролю використовували кДНК тканини товстої кишки від Clontech. GAPDH був виявлений як референсний ген. ПЛР у реальному часі проводили у трьох примірниках, середнє значення ± SD показано. (c, d) Деметилювання за допомогою Aza або в поєднанні з TSA (A + T) відновило експресію генів у клітинах LoVo або RKO. (e) Aza в поєднанні з відновленою TSA експресією SUSD2 аналізували в клітинах LoVo методом FACS. FACS виконували в трьох примірниках.

Повнорозмірне зображення

Передбачувані промотори CSBF / C10orf99 та SUSD2 , ідентифіковані за допомогою аналізу промотору біоінформатики (//www.genomatix.de), обидва містять нетипові острови CpG. Щоб дослідити, чи знижена регуляція цих двох генів метилюванням промотору, ми обробляли клітини LoVo та RKO деметілюючим агентом Aza, або поєднували з інгібітором гістондеацетилази трихостатином A (TSA). Супресор пухлини CMTM3 перевіряли як позитивний контроль 47 . Дійсно, експресія SUSD2 була відновлена ​​Aza або поєднана з TSA як на мРНК (рисунки 4c і 4d), так і на рівні білка (рисунок 4e), тоді як експресія CSBF / C10orf99 не відновлювалася. Ці результати наочно показують, що зниження регуляції цих двох генів має різні механізми.

CSBF / C10orf99 взаємодіє з SUSD2, щоб інгібувати ріст клітин ракової кишки

Оскільки CSBF / C10orf99 і SUSD2 є регульованими вниз в тканинах раку товстої кишки і клітинних лініях, ми припускали, чи мають CSBF / C10orf99 і SUSD2 вплив на ріст клітин раку товстої кишки. Як показано на Фіг.5а, проліферація клітин HCT116 або LoVo стала значно повільнішою у групі CSBF / C10orf99 та SUSD2, що експресуються спільно, порівняно з іншими групами. Ці результати свідчать про те, що інгібування росту не має клітинної специфічності, і CSBF / C10orf99 або SUSD2 не впливають на проліферацію клітин поодинці в швидко перенесеній системі. Для подальшого підтвердження, якщо інгібіторний ефект CSBF / C10orf99 залежить від існування SUSD2, ми використовували очищений рекомбінантний білок sSUSD2-Fc в блокуючих експериментах, а очищений рекомбінантний Fc використовували як негативний контроль. Як показано на малюнку 5b, блокада CSBF / SUSD2 з sSUSD2-Fc збільшувала проліферацію клітин LoVo.

Image

(a) Аналіз CCK-8 показав, що ріст клітин інгібується ко-експресією CSBF / C10orf99 та SUSD2 у клітинах HCT116 та LoVo. Показані дані є репрезентативними для щонайменше трьох незалежних експериментів. (b) Аналіз CCK-8 показав, що інгібування росту клітин LoVo було заблоковано додаванням білка sSUSD2-Fc в експерименті А. Показані дані є репрезентованими щонайменше для трьох незалежних експериментів. (c) Коекспресія CSBF / C10orf99 та SUSD2 гальмує утворення колоній у клітинах LoVo. Аналізи проводили в трьох примірниках, показано середнє значення ± SD. (d) Експресію SUSD2 в LoVo-SUSD2 аналізували за допомогою аналізу FACS. FACS виконували в трьох примірниках. (e) Аналіз CCK-8 показав, що клітини LoVo-SUSD2 мали нижчу швидкість росту клітин. Показані дані є репрезентативними для щонайменше трьох незалежних експериментів. (f) Аналіз утворення колоній показав, що клітини LoVo-SUSD2-1 # мають менше колоній. Аналізи проводили в трьох примірниках, показано середнє значення ± SD. (g) Аналіз RT-PCR показав тривалу позаматкову експресію SUSD2, відновив експресію CSBF / C10orf99, але не Gal1. Показані дані є репрезентативними для щонайменше трьох незалежних експериментів. (h) Аналіз утворення колонії показав, що інгібіторні ефекти SUSD2 можуть бути посилені додаванням CSBF / C10orf99. Аналізи проводили в трьох примірниках, показано середнє значення ± SD.

Повнорозмірне зображення

Далі ми провели аналіз утворення колоній, щоб підтвердити, що взаємодія між CSBF / C10orf99 та SUSD2 впливає на ріст клітин раку товстої кишки. Як показано на Фіг.5c, трансфіковані клітини LoVo культивували в існуванні G418 протягом двох тижнів. Значне зменшення колонії спостерігалось у клітинах LoVo, ко-експресованих CSBF / C10orf99 та SUSD2. Колонія одноекспресованих клітин SUSD2 також була меншою, ніж у клітин керування вектором, тоді як у клітинах, експресованих CSBF / C10orf99, не було явних змін. Цей результат свідчить про те, що тривалий виражений SUSD2 знижував ріст клітин LoVo.

Для подальшого підтвердження інгібіторних ефектів тривалої експресії SUSD2 на ріст клітин раку товстої кишки було створено стійкі клітини, що експресують SUSD2. Як показано на малюнку 5d, після скринінгу на вибір антибіотиків ми отримали два клітинних штами LoVo-SUSD2 (LoVo-SUSD2-1 #, LoVo-SUSD2-2 #) та два штами клітин LoVo-Neo (LoVo-Neo-1 #, LoVo-Neo-2 #). Як показано на фіг. 5E, клітини LoVo-SUSD2 показали менші темпи росту в аналізі CCK-8. Потім ми провели аналіз формування колонії з клітинами LoVo-SUSD2-1 # та LoVo-Neo-1 #. Як показано на малюнку 5f, колонія клітин LoVo-SUSD2-1 # була також значно меншою, ніж у клітин LoVo-Neo-1 #.

Щоб з'ясувати, чому тривала експресія SUSD2 гальмує ріст клітин, ми провели RT-PCR, щоб дослідити, чи підвищувався рівень CSBF / C10orf99. Як показано на малюнку 5g, CSBF / C10orf99 дійсно був регульований відновленою експресією SUSD2. Крім того, для уточнення впливу CSBF / C10orf99 на клітини LoVo-SUSD2, ми додали CSBF / C10orf99 в систему аналізу формування колоній. Як показано на малюнку 5h, CSBF / C10orf99 може суттєво посилити інгібуючий ефект росту SUSD2, але не в клітинах LoVo-Neo.

CSBF / C10orf99 взаємодіє з SUSD2, щоб викликати зупинку клітинного циклу G1

Зазвичай інгібування росту клітин індукується апоптозом або зупинкою клітинного циклу 48 . Наші результати показали, що не спостерігалося значного збільшення відсотка апоптотичних клітин (додаткова фігура S4). Потім ми додатково виявили клітинний цикл трансфікованих клітин LoVo за допомогою FACS. Як показано на Фіг. 6a та b, коли CSBF / C10orf99 співекспресувались із SUSD2 у клітинах LoVo, клітини фаз G0 / G1 значно збільшувались і клітини S фази зменшувались, але очевидних змін у інших групах не спостерігалось. Ці результати дозволяють припустити, що спільна експресія CSBF / C10orf99 та SUSD2 може викликати зупинку клітинного циклу G1. Далі ми дослідили декілька ключових регуляторів клітинного циклу методом Вестерн-блоттінгу. Як показано на малюнку 6c, циклін D1, циклін D3 і CDK6 були регульовані внизу в CSBF / C10orf99 і SUSD2, ко-експресують клітини LoVo, що відповідає фенотипам зупинки клітинного циклу G1. У той час як експресія цикліну В1 не змінювалася, що полягає у невизначеному зміні фази G2 / M. В цілому ці результати підтвердили, що CSBF / C10orf99 взаємодіє з SUSD2, щоб викликати зупинку клітинного циклу G1.

Image

(a) проточна цитометрія була використана для порівняння вмісту ДНК між макетними, CSBF-експресуючими, SUSD2-експресуючими та ко-експресуючими клітинами. Підсумок пропорцій клітин у різних фазах клітинного циклу (b). Результати виражали як середнє ± SD трьох незалежних експериментів. (c) Експресія білка цикліну B1, цикліну D1, цикліну D3 та CDK6 була виявлена ​​вестерн-блоттом (зліва). β-тубілін використовували як внутрішній контроль. І з трьох незалежних експериментів рівні білків, пов'язаних з клітинним циклом, нормалізувались до β-тубліну (справа).

Повнорозмірне зображення

Обговорення

Цитокіни, як правило, є білками невеликої секреції з оптимальною активністю при досить низьких концентраціях, і їх функції залежать від зв'язування конкретних рецепторів 49 . У цьому дослідженні ми виявили новий потенціал цитокіну CSBF / C10orf99, використовуючи імуногенетику. CSBF / C10orf99 - класичний секретується білок з регулярним N-кінцевим сигнальним пептидом з 24 амінокислот. SUSD2 незамінний для інгібуючого ефекту росту CSBF / C10orf99 на клітини раку товстої кишки, а рекомбінантний sSUSD2-Fc може блокувати його функції. CSBF / C10orf99 відображає дзвіноподібну криву активності, її оптимальний ефект становить близько 10 нг / мл, що відповідає характеристикам цитокінів.

Наскільки нам відомо, це перше системне дослідження CSBF / C10orf99. Аналіз GEO профілю показав, що 2610528A11Rik, гомолог миші CSBF / C10orf99, був значно регульований в моделях миші на псоріаз (GDS3907). Крім того, CSBF / C10orf99 також був регульований у хворих на псоріаз (GDS3539). Тим часом CSBF / C10orf99 вважають, що він бере участь у патогенезі псоріазу 50, який є хронічним імунологічним захворюванням шкіри та суглобів, за яким традиційно вважають, що він бере участь у шляху Th1. Оскаржуючи овалбумін, Tang та ін. повідомляли, що гомозиготні миші з нокаутом 2610528A11Rik демонстрували підвищену середню рівень IgG2a сироваткової відповіді 51, що є маркером ізотипового імуноглобуліну для T-хелпера 1 (Th1) лімфоцитів, вказуючи на те, що 2610528A11Rik може інгібувати клітини Th1 для регуляції адаптивних імунних відповідей. Необхідні подальші дослідження для з'ясування функції CSBF / C10orf99 в імунних реакціях клітин Th1.

Експресійні та функціональні характеристики CSBF / C10orf99 вказують, що він може бути супресором пухлини. Його ген розташований на хромосомі 10q23.1 поруч з геномною областю пухлинного супресору PTEN (10q23.3) 52 . Інактивація ТТГ за допомогою метилювання промотору, мутації генів або втрати гетерозиготності важлива для канцерогенезу. У клітинних лініях раку товстої кишки людини експресія CSBF / C10orf99 не може бути відновлена ​​Aza або поєднана з TSA, що вказує на те, що вона не регулюється метилюванням промотору. Механізм, що лежить в основі зниження рівня регулювання CSBF / C10orf99, ще належить вивчити. Необхідно враховувати можливі ролі генетичного та / або іншого епігенетичного контролю. Промотор SUSD2 містить нетипові острови CpG, але він може бути відновлений Aza або поєднаний з TSA, що вказує на те, що метилювання промотору безпосередньо маніпулює його експресією або транскрипційні фактори, що регулюють його експресію, регулюються епігенетично.

Вражаюче, вища експресія CSBF / C10orf99 та SUSD2 також виявлена ​​у кількох зразках раку товстої кишки (7/42 та 4/42), що схоже на посилення експресії пухлинного супресору p16 у багатьох злоякісних пухлинах. Існує кілька можливих механізмів з'ясування того, чому виникає переекспресія p16. З одного боку, часткова втрата функції p16 через мутації дурних помилок може бути компенсована підвищеною експресією, що спостерігається у деяких зразків пухлини. З іншого боку, у присутності p16 дикого типу, інші молекулярні події, такі як надмірна експресія CDC6 та цикліну D1, або дерегуляція Rb у пухлинних клітинах та ракових тканинах мають потенційний позитивний зворотний зв'язок щодо експресії p16 53, 54 . Враховуючи ці наявні механізми та наші результати, у згаданих зразках можуть бути мутації CSBF / C10orf99 та SUSD2, або інших молекул нижче за течією.

Sugahara та його колеги продемонстрували, що позаматкова експресія Susd2, мишачого гомолога SUSD2, може інгібувати ріст та зворотні пухлиногенні фенотипи клітин HT1080 та клітин HeLa in vitro 55, 56 . Їх результати показали, що Susd2 є можливим супресором пухлини, який подібний до наших результатів. Ватсон та ін. повідомлялося, що SUSD2 взаємодіє з Gal1, і локалізація поверхні клітин Gal1 залежить від існування SUSD2 44 . Взаємодія SUSD2 з Gal1 посилила інвазію на клітини раку молочної залози і може зіграти значну роль у модуляції імунної відповіді організму. Аналіз GEO профілю показав, що SUSD2 значно регулюється альфа-мовчаними клітинами раку молочної залози з рецептором естрогенів (ER) (GDS4061), і він був регульований в ER позитивних клітинах (GDS4067) та деяких клітинах аденокарциноми яєчників (GDS3592). Тим часом Gal1 є повідомленим лігандом SUSD2 і бере участь у трансформації пухлини, ангіогенезі, регуляції клітинного циклу та апоптозі 57 . Наші результати показали, що спорідненість між CSBF / C10orf99 і SUSD2 аналогічна аналогічній для Gal-1 і SUSD2, але функції різні. Ці результати сукупно говорять про те, що на експресію та функцію SUSD2 можуть впливати естроген, ліганди та мікросередовище.

Це дослідження показує, що CSBF / C10orf99 пригнічує фазовий перехід G1-S через циклин D і CDK6, що регулюються вниз. Фазовий перехід G1-S є головним контрольним показником прогресування клітинного циклу 58 . Необхідно визначити внутрішньоклітинні взаємодіючі білки SUSD2 та з'ясувати його механізм модуляції цикліну D та CDK6 у майбутньому дослідженні, що буде корисним для розуміння патогенезу раку товстої кишки.

Методи

Клітинні лінії, реактиви та зразки раку

Клітини HEK 293T, HCT116, HT29, LoVo, SW480, SW620 і RKO були отримані від наших співробітників і підтримувались у DMEM (GIBCO), доповненому 10% FBS (HyClone). CSBF / C10orf99 синтезували в Китайській пептидній компанії (Ханчжоу, Китай) із чистотою> 97%. Gal1 був придбаний у R&D Systems (1152-GA-050). Антитіла, використані в цій роботі, були: мишачі анти-мік (9E10) (# SAB4700447, Sigma-Aldrich), кролячі анти-HA (C29F4) (# 3724, Технологія клітинного сигналу), козячий анти-людський IgG (специфічний для Fc) (# I2136, Sigma-Aldrich), антициклін D1 (# 2926, Технологія клітинного сигналу), антициклін D3 (# 2936, Технологія клітинного сигналу), анти-CDK4 (# 2906, Технологія клітинного сигналу), анти-CDK6 (# 3136, Cell Signaling Technology), anti-phospho-Cyclin B1 (Ser147) (# 4131, Cell Signaling Technology), anti-SUSD2 rabbit polyclonal antibody (# HPA004117, Sigma-Aldrich), anti-β-tublin (# T8328, Sigma -Aldrich) and anti-GAPDH (# 2118, Cell Signaling Technology). Primary cancer tissues and paired adjacent tissues were obtained from patients under primary surgery at Peking University Cancer Hospital (Beijing, China), with patients' consent and institutional ethics approval. Fresh human tissues were fixed with 10% formalin in PBS for immunohistochemistry, or frozen in liquid nitrogen for RNA extraction. This investigation was carried out after approval by the Ethics Committee of Peking University Cancer Hospital.

Molecular cloning and sub-cloning of CSBF/C10orf99 and SUSD2

CSBF/C10orf99 was amplified from PBMC by PCR with primers: 5′-CAgaattcCACCATGAGGCTTCTAGTCCTTTC-3′ and 5′-GCggtaccCCCACCTGTGGGAGTGCCCCAG-3′, digested with Eco RI and Kpn I and ligated into pEGFP-N1 (Clontech). This plasmid was then digested with Eco RI and Bam HI and ligated into pcDNA3.1(-)-myc-His, pCMV-3×Flag-C and pwYD11 (containing fused human IgG1 Fc tag) to obtain pcDNA3.1-CSBF-myc-His, pCMV-CSBF-Flag and pwYD11-CSBF-Fc, respectively. SUSD2 was amplified from HCT116 cDNA library with primers: 5'-CCgaattcGCCACCATGAAGCCAGCCCTCCTGC-3' and 5'-CCgaattcGGGCTGTGCACCCCAGACG-3', digested with Eco RI and cloned into pCMV-C-HA. The EGFP-tagged SUSD2 plasmid was constructed using the full-length SUSD2 as a template for PCR with a pair of primers: 5'-CCgaattcGCCACCATGAAGCCAGCCCTCCTGC-3' and 5'-GGaccggtCCGGGCTGTGCACCCCAGACGT G-3', digested with Eco RI and Age I and cloned into the pEGFP-N1 plasmid. The truncated plasmids of SUSD2-HA were constructed by standard method of site-directed mutagenesis by overlapping extension using the polymerase chain reaction (PCR) with different PCR primer sets presented in Supplementary Table S1.

Імунофлюоресцентна мікроскопія

The cells were seeded on coverslips for 24 hours. At 24 hours post-transfection, the cells were washed and fixed for 20 minutes with prepared 4% PFA, rinsed in serum-free medium, and permeabilized for 30 min in 0.1% Triton X-100 and 3% BSA in PBS. Cells were incubated in succession with intervening washing, with primary antibody overnight at 4°C, and secondary antibody for 60 minutes at room temperature. Primary antibodies were the mouse anti-myc (9E10) and rabbit anti-HA (C29F4) diluted 1:1000. Rhodamine-conjugated secondary antibodies were applied for detection. To stain the nuclei, the cells were incubated for 60 minutes with 0.05 μg/ml Hoechst33342 dye (Sigma-Aldrich). Coverslips were mounted, sealed, examined and photographed under a confocal laser scanning microscope (Leica TCS SP5 Microsystems, Germany).

BFA inhibition assay

At 24 hours post-transfection, HEK 293T cells were addition of either 10 μg/ml of BFA (# B7651, Sigma-Aldrich) or ethanol (vehicle control), and cultured for another 24 h. Finally, the total cell lysates and the culture supernatants were harvested for Western blot analysis.

Аналіз Вестерн-блот

Details have been described previously 59 . Briefly, samples were separated and transferred onto nitrocellulose membranes, blocked and incubated in succession with primary antibody overnight at 4°C and then with horseradish peroxidase-coupled secondary antibody at a dilution of 1:2000. After washing, immunoreactive bands were detected by Odyssey Infrared Imager (LICOR Bioscience, Lincoln, NE, USA).

Antibodies used were: anti-myc (9E10), anti-Human IgG (Fc specific), anti-HA (C29F4), anti-cyclin D1, anti-cyclin D3, anti-CDK4, anti-CDK6, anti-phospho-Cyclin B1 (Ser147), anti-SUSD2 rabbit polyclonal antibody, anti-β-tublin, anti-GAPDH and IRDye secondary antibodies against mouse, rabbit or goat immunoglobulin G (Li-Cor Biosciences). The anti-CSBF/C10orf99 rabbit polyclonal antibody and were made in our lab.

Co-IP assays

The transfected HEK 293T cells were lysed in buffer containing 50 mM HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 10% glycerol, 1 mM EDTA (pH 8.0) and protease inhibitor cocktail. Cell extracts were clarified by centrifugation, and the resulting supernatant was incubated overnight at 4°C with anti-HA or anti-Flag and then with protein G plus agarose beads. After intensive washing and centrifugation, immune complexes were analyzed by Western blotting.

Ligand-dependent internalization of SUSD2

LoVo cells were seeded on coverslips for 24 hours. After transfected with pEGFP-N1-SUSD2 (SUSD2-EGFP) or vector control, cells were cultured for another 24 hours. Then different doses of CSBF/C10orf99 were added to the medium for 30 minutes. BSA was added as reagent control. Coverslips were mounted, sealed, examined and photographed under a confocal laser scanning microscope.

FRET microscopy and image analysis

HEK 293T cells were seeded on coverslips for 24 hours. After transfected with EGFP-mCherry, EGFP, mCherry, CSBF-mCherry, Gal1-mCherry, SUSD2-EGFP, EGFP+CSBF-mCherry, EGFP+Gal1-mCherry, SUSD2-EGFP+mCherry, SUSD2-EGFP+CSBF-mCherry, SUSD2-EGFP+Gal1-mCherry, cells were cultured for another 24 hours. Gal1 was used as ligand control. Coverslips were mounted, sealed, examined and photographed under a confocal laser scanning microscope. Images were acquired under SP5-FRET acquisition module by interline scanning for EGFP (488 nm excitation; 510 nm emission) and mCherry (514 nm excitation; 600 nm emission), respectively. FRET efficiency was analyzed under SP5-FRET analysis module. Over 10 cells were gained in each group, and 10 ROIs were gained on each cell.

Radioligand binding to SUSD2

CSBF / C10orf99 та Gal1 були позначені 125 I методом хлораміну-T (ch-T). Рекомбінантний sSUSD2-Fc використовували в якості потенційного рецептора в реакції зв'язування. 125 I-Gal1 додавали до реакції зв'язування з не маркованим Gal1 7 відповідних концентрацій (60, 30, 15, 7, 5, 3, 75, 1, 875 та 0, 9375 пг / мкл). Після закінчення часу інкубації 24 години при 4 ° С, незв’язуючий 125 I-Gal1 відокремлювали від реакційної суміші осадженням пов'язаного 125 I-Gal1 поліетиленгліколем (PEG6000). Після центрифугування супернатант видаляли і зв'язаний радіоліганд підраховували у рідкому сцинтиляційному гамма-лічильнику. Результати, отримані зі стандартів, були використані для побудови стандартної кривої дози та відповіді. Неспецифічне зв'язування визначали в межах кожної експериментальної серії. Тим часом 125 I-CSBF додавали до реакції зв'язування з міченим CSBF 7 відповідних концентрацій (100, 50, 25, 12, 5, 6, 25, 3, 125 і 1, 5625 пг / мкл).

Напівкількісний аналіз RT-PCR та ПЛР у реальному часі

Клітини бібліотек кДНК людини з множинними тканинами та тканини імунної системи були придбані у компанії Clontech. Загальну РНК з клітин раку товстої кишки виділяли за допомогою реагенту TRIzol (Invitrogen) і використовували як шаблон для синтезу кДНК. CSBF / C10orf99 ампліфікацію ПЛР проводили за допомогою наступних праймерів: 5'-CTCCACAGAAGGGAAGAGGCG-3 'і 5'-GGACCACTGGATGCTGGTAG-3'; Підсилення ПЛР SUSD2: 5'-CTTCTTCACGGACTACGGCT-3 'і 5'-GACACACTCAGGAACGGG-3'; Ампліфікація ПЛР Gal1: 5'-ATGGCTTGTGGTCTGGT-3 'і 5'-CAGAGGGAGCAGAGGCA-3'; і GAPDH ПЛР-ампліфікація: 5'-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3 'і 5'-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'. Кількісну ПЛР проводили за системою детектування послідовності ABI PRISM 7000 (прикладні біосистеми). Умови ампліфікації становили 10 хв початкової денатурації при 95 ° С, а потім 40 циклів кожні 15 с при 95 ° С та 1 хв при 60 ° С. Ампліфікацію CSBF / C10orf99 проводили за допомогою наступних праймерів: 5'-GGTCAGGCAGGAGAACCAG-3 'та 5'-AGCTTGCATGGTTTACAGAGC-3'. Праймери для ампліфікації SUSD2 використовували 5'-AGAGCTGGATGGACCTGAAA-3 'та 5'-ATGCCAGCATGATGGAGAGAC-3'. Зразки проводили в трьох примірниках. Всі зразки нормалізували проти GAPDH за допомогою порівняльного методу Ct (ddCt).

Імуногістохімія

Слайди тканин людини були депарафінізовані, регідровані та заблоковані 10% нормальною сироваткою кози протягом 30 хв. Потім слайди інкубували при 37 ° С протягом 1 години із кролячим анти-CSBF / C10orf99 або антиклональним антитілом SUSD2. Антитіла проти CSBF / C10orf99 готували та очищали за афінністю в нашій лабораторії. Після ретельного промивання на 30 хв наносили Dakocytomation Envision System HRP (DakoCytomation, США). Після промивання в PBS всі слайди візуалізували 0, 05% (мас. / Об.) 3, 3 '-діамінобензидину.

Аналіз клітинної проліферації

Клітини збирали, висівали в 96-лункові планшети при щільності 2000 клітин на лунку і інкубували при 37 ° С. Клітинну проліферацію аналізували, використовуючи Kit Counting Kit-8 (CCK-8) (Dojindo Molecular Technologies, Японія). У вказані моменти часу в кожну лунку додавали 10 мкл розчину CCK-8 та інкубували протягом 2 год. Для обчислення кількості життєздатних клітин вимірювали абсорбцію при 450 нм і 630 нм.

Аналіз формування колонії

Формування колонії аналізували шляхом висадки 200 клітин у культуральні планшети з 12 лунками (у трьох примірниках). Через 8 днів колонії фіксували і фарбували 0, 5% кристалічним фіолетовим кольором. Колонії були визначені як мінімум 50 комірок у групі та підраховувались за допомогою програмного забезпечення для аналізу зображень (IPP6).

Проточна цитометрія

Для аналізу експресії SUSD2 фіксовані та проникнені клітини фарбували мишачим моноклональним антитілом W5C5 (Каталог № 327401, BioLegend) або відповідним контролем ізотипу (миша IgG1, каппа) (Каталог №401401, BioLegend). Мічені клітини використовували для проточного цитометричного аналізу FACSCalibur (BD Biosciences). Дані аналізували за допомогою програмного забезпечення FlowJo (Tree Star).

Аналіз клітинного циклу

Клітини збирали і фіксували в 70% етанолі, обробляли РНКазою А та фарбували йодидом пропіюму, а вміст ДНК аналізували FACSCalibur. Результати аналізували за допомогою програмного забезпечення ModFit.

Статистичний аналіз

Дані були виражені як середнє значення ± SD та перевірені на статистичну значимість за допомогою двосхилого t-тесту Стьюдента або ANOVA з відповідними коефіцієнтами між та в межах суб'єктів для кожного експерименту. Значення р <0, 05 вважали статистично значущими, де * = р <0, 05, ** = р <0, 01, а *** = р <0, 001.

Додаткова інформація

Word документи

  1. 1.

    Додаткова інформація

    CSBF / C10orf99, новий потенційний цитокін, інгібує ріст клітин раку товстої кишки через індукцію арешту G1

Коментарі

Надіславши коментар, ви погоджуєтесь дотримуватися наших Умов та Правил спільноти. Якщо ви виявите щось образливе або не відповідає нашим умовам чи інструкціям, будь ласка, позначте це як невідповідне.